Advanced Science ：基于纏結微束型水凝膠的3D生物打印
基于擠出式的3D生物打印技術已經被廣泛應用于創建多種功能組織類似結構體，包括心肌、骨骼肌、肝臟、皮膚、骨骼和軟骨等。通常，生物墨水是由水凝膠前驅體制備得來的。通過改變水凝膠前驅體的流變特性，使得生物墨水在擠出時可作為連續的凝膠細絲沉積在支撐平臺上。與液體生物墨水相比，微凝膠生物墨水被認為是一種新興的生物墨水，這種生物墨水具有固有的剪切變稀和剪切恢復特性。同時，由于微凝膠之間存在內在空隙，與塊體凝膠材料相比，微凝膠生物墨水中的細胞具有更高的生存能力、擴散和遷移能力。
近期，蘇黎世大學健康科學與技術系MarcyZenobi-Wong教授團隊將塊狀水凝膠擠壓通過微米大小孔徑的網格，將水凝膠分解成微束型凝膠網絡。軟骨細胞與凝膠微束的共沉積3D生物打印形成的凝膠支架可誘導軟骨細胞形成豐富的細胞外基質，使其壓縮模量得到顯著地提升。該研究中微束型水凝膠的構建策略為3D打印生物墨水提供了一種新型的制備手段。相關研究論文：“3D Bioprinting of Macroporous Materials Based on Entangled Hydrogel Microstrands”發表于Advanced Science上。
圖1 纏結微束型凝膠網絡的構建及3D生物打印示意圖
凝膠材料：
甲基丙烯酰化透明質酸（HA-MA）、甲基丙烯酰化明膠（GelMA）、明膠
工藝：
UV交聯HA-MA（濃度2%w/v，接枝率28%）或GelMA（濃度2%w/v，接枝率92%）/明膠塊體水凝膠通過孔洞為40~100μm的篩子進行機械擠壓。這一過程將凝膠塊體分解成凝膠微束，這些微束隨機地相互纏繞，組成一種高縱橫比水凝膠組成的結構化材料。
1. 纏結微束型凝膠的穩定性和宏觀孔隙率：
為了研究3D打印纏結微束型凝膠的可調性，研究者通過調整UV交聯時間（20s、60s、180s）制備了一系列不同交聯強度的HA-MA體系凝膠。對比顆粒水凝膠，37℃下浸泡于PBS 7天中，塊體微凝膠在1h內瓦解掉，而纏結微束型水凝膠在水介質中具有長期的凝聚力。為了評估HA-MA纏結微束型凝膠的孔隙率，研究者將凝膠浸入高分子量葡聚糖熒光染料中。由于葡聚糖的分子量較大，圖2H顯示出熒光標記的葡聚糖只能進入凝膠束之間，而無法穿透水凝膠的凝膠相，基于此，研究者可用來計算凝膠的孔隙率（圖2）。
圖2 纏結微束型凝膠網絡的穩定性和宏觀孔隙率
2. HA-MA纏結微束型凝膠的剪切變稀及剪切恢復特性：
纏結微束型凝膠表現出剪切變稀的流變學特性，這是擠出式3D生物打印所必需的。通過流變學測定，不同交聯強度的HA-MA微束型凝膠的剪切恢復率不同，且隨著篩網孔徑的不同而改變，通過比對，研究者指出中等交聯強度的纏結微束型凝膠樣在初始剪切后的剪切恢復率為81.8% (篩網孔徑40 μm)和82% (篩網孔徑100 μm)，明顯優于其他兩組，可作為優良的3D打印生物墨水（圖3）。
圖3 HA-MA纏結微束型凝膠網絡的流變特性
3. 纏結微束型凝膠的3D打印特性：
基于HA-MA微束型凝膠，研究者3D生物打印出兩層網格結構。交聯率越高的凝膠樣品在較短的拉伸距離下越易斷裂，印刷精度也就越高。此外，考慮到纏結微束型水凝膠的流變學特性，中等交聯強度的纏結微束型凝膠樣是最優良的生物墨水。兩種孔徑尺寸（40μm和100 μm）的流變性能和印刷性能沒有明顯差異，但孔徑尺寸對空隙率有顯著影響，因此可以根據實際應用選擇該參數來調整凝膠的宏觀孔隙率。另外研究者還測試了其他水凝膠體系（GelMA、卡拉膠及酶或化學交聯的HA等），經預交聯過濾形成微束型凝膠后，再進行擠出式3D生物打印。測試結果表明所有的凝膠體系均可形成纏結的微絲并3D打印出網格支架。
圖4 纏結微束型凝膠的擠出式3D可打印性和各向異性
4. 負載細胞的纏結微束型凝膠的3D生物打印：
研究者分別采用兩種方法探究纏結微束型凝膠的負載細胞能力：方法一，首先，細胞被嵌入到塊體水凝膠中，然后水凝膠被擠壓成凝膠微束；方法二，被擠壓成型的凝膠微束與細胞懸液混合，使細胞占據微束間的孔隙。采用方法一，研究者選擇明膠復合GelMA水凝膠探究纏結微束型凝膠負載小鼠成肌細胞（C2C12）的能力，鈣黃素AM染色結合Hoechst 染色顯示細胞融合并形成沿微絲方向排列的多核肌管（圖5）。采用方法二，研究者選擇HA-MA水凝膠微束和軟骨細胞復合，結果顯示軟骨細胞在3D生物打印后表現為圓形表型，但在培養7天和21天后增殖并顯示出更長的梭型（圖6）。
圖5 纏結微束型凝膠可誘導成肌細胞的肌管形成
圖6 纏結微束型凝膠負載軟骨細胞的高細胞活性3D打印
5. 體外負載軟骨細胞的纏結微束型凝膠誘導軟骨再生：
負載軟骨細胞的HA-MA纏結微束型凝膠培養42天后，凝膠塊呈白色軟骨狀，表明了致密的細胞外基質沉積。為了證實這一點，研究者對培養的組織結構進行軟骨特異性標志物染色，染色結果表明相關的蛋白多糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原均得到高表達，其中Ⅱ型膠原在42天后，膠原染色增強，表現為微束內沉積及水凝膠網絡中的沉積。隨后，研究者對比了3D打印凝膠微束負載軟骨細胞培養21天及42天前后的壓縮模量，其模量由2.7 ± 0.3 kPa增加至212 ± 83.7 kPa，后增加至780.2 ± 218.4 kPa。雖然此機械強度遠不及原生軟骨組織的壓縮模量（1829.8 ± 72 kPa），但仍是一個顯著的進步。由于本研究中使用的材料本身的抗壓縮能力很小，壓縮模量的變化完全可以歸因于細胞外基質的大量沉積和成熟（圖7）。
圖7 纏結微束型凝膠誘導軟骨再生
6. 總結：
該研究以高縱橫比水凝膠微束為生物墨水，該生物墨水中的凝膠微束相互纏結形成多孔且穩定的凝膠網絡。且該纏結微束型凝膠能夠促進成肌細胞的肌管形成，并維持相對較高的細胞活性（90%）。軟骨細胞與凝膠微束共沉積打印形成的凝膠支架可誘導軟骨細胞形成豐富的細胞外基質，使其壓縮模量得到顯著地提升。該研究中微束型水凝膠的構建策略為3D打印生物墨水提供了一種新型的制備手段。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1002/advs.202001419
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