3D生物打印含血小板衍生物的顆粒狀水凝膠
組織是具有層次結構的，由具有生物活性的動態細胞外基質和多個細胞群組成。細胞外基質成分相互連接，以建立獨特的成分和拓撲結構，為細胞提供結構和生物化學上的支持以及調控細胞行為（如增殖、生長、遷移、分化）。此外，細胞外基質還可以動態地和局部地調節可溶性和固定化分子的釋放。水凝膠由于其水合網絡和獨特的理化性質可以調節細胞行為，常被用做細胞外基質的模擬物。微凝膠是一種通過自下而上工程策略制備的新型墨水。與傳統的塊狀水凝膠相比，微凝膠具有顯著的孔隙率、增加的比表面積、模塊化以及優良的可控機械響應。
近期，美國賓夕法尼亞大學生物工程系Jason A. Burdick教授團隊將可光交聯的降冰片烯修飾的透明質酸（NorHA）與人血小板裂解物（PL）結合起來，結合微流控技術制備了具有層次化纖維網絡的球形PL-NorHA微凝膠。這種微凝膠具有剪切變稀和自愈特性，可以通過3D打印技術制造穩定的3D結構。相關研究論文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”發表于Acta Biomaterialia上。
工藝：PL-NorHA水凝膠的合成：NorHA與PL基質在室溫下孵育20min，然后可見光固化5min，以形成PL-NorHA水凝膠。
PL-NorHA微凝膠的制備：將前驅液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驅液2(PBS或PL)分別以1μl/min和2μl/min的流速導入微流控設備。在出口處(≈28 cm)，啟動凝膠，然后經可見光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝膠的表征為了分析PL-NorHA水凝膠的纖維結構，研究者將熒光纖維蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦顯微鏡觀察。圖2A-i,ii顯示，當NorHA濃度為1%和2%時，水凝膠顯示出類似于典型的分層纖維基質的相互連接和均勻的纖維結構。這種多尺度屬性的引入重現了天然ECM從納米尺度到微米尺度的分級組織的復雜性。為了更好的了解所得水凝膠的凝膠動力學和網絡特性，研究者分析了它們的凝膠過程和粘彈特性(圖2b-i~iv)。在可見光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血劑)和PL-NorHA(即添加凝血劑)具有較低的儲存模量，其機制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，當暴露在可見光下時，由于硫醇-烯反應的共價光交聯反應，彈性模量和粘性模量增加，并在幾秒鐘內達到儲存模量平臺(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝膠(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比僅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白質的NorHA水凝膠(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的儲能模量。
2. PL-NorHA水凝膠中蛋白質的釋放HA的生物合成和組織周轉受合成酶和透明質酸酶的調節。研究者利用對水凝膠中糖醛酸或總蛋白的量化，繪制了水凝膠的體外降解曲線(圖2C)。研究發現，在透明質酸酶存在的情況下，水凝膠的總降解時間和降解速度更快。降解時間與交聯密度之間也存在相關性，高濃度(2wt.%)的降解速度慢于低濃度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝膠的降解速度比NorHA快(圖2c- i,iii)。這是由于PL-NorHA水凝膠除了共價光交聯網絡(NorHA)外，還含有交聯的PL蛋白結合的纖維基質。因此，PL-NorHA水凝膠的降解不僅是由于糖醛酸的釋放（代表HA降解），也與纖維蛋白基質的降解有關。1wt.%的PL-NorHA水凝膠(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝膠(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白釋放。這些結果表明，HA大分子濃度和纖維蛋白基質的不同組合，可以調節載藥水凝膠中藥物的釋放。
4. 微凝膠的制備及表征將含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通過兩個獨立的通道引入到Y形微流控芯片中，匯聚成一個層流的通道以促進纖維蛋白的聚合。然后，這個單一通道被不相容的連續相截斷，產生油包水液滴。經過蛇形路徑時，纖維蛋白進一步聚合，在通道末端經可見光交聯，形成微凝膠（如圖4a）。研究者在微凝膠形成過程中摻入熒光素標記的葡萄糖，以分析其形態（包括大小和圓度）(圖4b，c)。PL-NorHA微凝膠產生了均一和分層的纖維蛋白網絡(圖4b- ii)。球形微凝膠的平均直徑分別為120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(圖4c-i,ii)。通過糖醛酸和總蛋白的釋放，研究者對微凝膠的降解進行評估。研究發現，微凝膠在透明質酸酶存在時表現出降解趨勢，且濃度低的微凝膠比濃度高的微凝膠降解速度更快；PL-NorHA微凝膠的降解速度比NorHA微凝膠更快；微凝膠狀態的降解速度比水凝膠狀態更快(圖4d-i, iii)。對總蛋白釋放定量，發現7天后，在有或無透明質酸酶的作用下，PL-NorHA的總蛋白釋放量分別為41%±7%和69%±3%。綜上研究表明，微凝膠的穩定性和治療相關蛋白的釋放速率可以通過改變交聯密度以及透明質酸酶濃度來調整。
5. 顆粒水凝膠的流變特性為了研究微凝膠的可打印性，研究者評估了微凝膠的流變特性和結構(圖5)。振蕩剪切流變實驗結果表明，當NorHA聚合物在微凝膠中的濃度從1%增加到2%時，顆粒水凝膠的儲存模量增加了一個數量級(圖5a-I, iv)。與在水凝膠中的觀察結果一致，PL的存在顯著降低了顆粒水凝膠的存儲模量(分別從77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝膠具有剪切稀釋性和自愈性的流變特性，可以在不改變初始性能的情況下以最小的力擠出。從不同濃度的微凝膠(1wt.%和2wt.%)制備的顆粒狀水凝膠都隨著應變的增加而表現出剪切屈服(圖5a-ii，v)。通過一系列高(500%)和低(0.5%)應變掃描，觀察到所有顆粒水凝膠的自恢復行為。在受到高應變后，材料表現出快速的類固體行為恢復(圖5a-iii，vi)。為了更好地觀察顆粒水凝膠的結構，研究者在制作油包水液滴前將微凝膠與羅丹明硫醇孵育以進行可視化。結果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠顯示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝膠增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝膠的孔隙率最大。這可能是由于微凝膠的粘彈性造成的。微凝膠的低力學擠壓增加了它們的堆積密度，且減小了表面積（圖5B）。
6. 3D打印顆粒水凝膠及其體外細胞響應為了評估微凝膠墨水的可打印性，研究者將含有FITC-葡聚糖的微凝膠呈細絲狀打印在載玻片表面，并用熒光顯微鏡觀察(圖6a)。由于其顆粒狀結構，微凝膠墨水很容易擠出形成均勻的細絲，呈現密集堆積的微凝膠形態。進一步，研究者使用微凝膠墨水進行3D打印以制造3D構造(圖6b-i)。濃度較低的微凝膠墨水產生穩定的3D結構(圖6b-ii, iii, v)，濃度較高的NorHA微凝膠產生的結構容易破壞(圖6b-iv)。除了結構的完整性，打印的結構也顯示出高保真度。隨后研究者使用負載MSCs細胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠進行3D打印。生長在NorHA微凝膠上的MSCs顯示出圓形的形態(圖6c-i)，類似于NorHA水凝膠得到的結果；而PL-NorHA微凝膠中相互連接的微孔空間促進了MSCs細胞的大量遷移與3D細胞網絡的形成(圖6c-i, iii)。這表明PL衍生蛋白可以促進細胞黏附和存活，并且可以形成可提供細胞錨點的分級纖維蛋白網絡。
近期，美國賓夕法尼亞大學生物工程系Jason A. Burdick教授團隊將可光交聯的降冰片烯修飾的透明質酸（NorHA）與人血小板裂解物（PL）結合起來，結合微流控技術制備了具有層次化纖維網絡的球形PL-NorHA微凝膠。這種微凝膠具有剪切變稀和自愈特性，可以通過3D打印技術制造穩定的3D結構。相關研究論文：“Injectable hyaluronic acid and platelet lysate-derived granular hydrogels for biomedical applications”發表于Acta Biomaterialia上。
圖1 PL-NorHA水凝膠和微凝膠的制備
凝膠材料：可光交聯的降冰片烯修飾的透明質酸（NorHA）工藝：PL-NorHA水凝膠的合成：NorHA與PL基質在室溫下孵育20min，然后可見光固化5min，以形成PL-NorHA水凝膠。
PL-NorHA微凝膠的制備：將前驅液1(NorHA或含凝血因子的NorHA)和前驅液2(PBS或PL)分別以1μl/min和2μl/min的流速導入微流控設備。在出口處(≈28 cm)，啟動凝膠，然后經可見光固化形成聚合物液滴。
1. PL-NorHA水凝膠的表征為了分析PL-NorHA水凝膠的纖維結構，研究者將熒光纖維蛋白原加入PL溶液中，并用共聚焦顯微鏡觀察。圖2A-i,ii顯示，當NorHA濃度為1%和2%時，水凝膠顯示出類似于典型的分層纖維基質的相互連接和均勻的纖維結構。這種多尺度屬性的引入重現了天然ECM從納米尺度到微米尺度的分級組織的復雜性。為了更好的了解所得水凝膠的凝膠動力學和網絡特性，研究者分析了它們的凝膠過程和粘彈特性(圖2b-i~iv)。在可見光照射前(20min)，NorHA、NorHA蛋白(即不加凝血劑)和PL-NorHA(即添加凝血劑)具有較低的儲存模量，其機制相似(G’≈1-2Pa和G’’≈0.4-1Pa)。然而，當暴露在可見光下時，由于硫醇-烯反應的共價光交聯反應，彈性模量和粘性模量增加，并在幾秒鐘內達到儲存模量平臺(2b-i-iv)。PL-NorHA水凝膠(G’：593±156Pa-1wt.%和G’：3536±159Pa-2wt.%)比僅含NorHA(G’：1655±238Pa-1wt.%和G’：4845±376Pa-2wt.%)或含有蛋白質的NorHA水凝膠(G’：1561±75Pa-1wt.%和G’：5324±722Pa-2wt.%)具有更低的儲能模量。
2. PL-NorHA水凝膠中蛋白質的釋放HA的生物合成和組織周轉受合成酶和透明質酸酶的調節。研究者利用對水凝膠中糖醛酸或總蛋白的量化，繪制了水凝膠的體外降解曲線(圖2C)。研究發現，在透明質酸酶存在的情況下，水凝膠的總降解時間和降解速度更快。降解時間與交聯密度之間也存在相關性，高濃度(2wt.%)的降解速度慢于低濃度(1wt.%)。此外，PL-NorHA水凝膠的降解速度比NorHA快(圖2c- i,iii)。這是由于PL-NorHA水凝膠除了共價光交聯網絡(NorHA)外，還含有交聯的PL蛋白結合的纖維基質。因此，PL-NorHA水凝膠的降解不僅是由于糖醛酸的釋放（代表HA降解），也與纖維蛋白基質的降解有關。1wt.%的PL-NorHA水凝膠(92±1%)比2wt.% PL-NorHA水凝膠(72±2%)具有更高的PL衍生蛋白釋放。這些結果表明，HA大分子濃度和纖維蛋白基質的不同組合，可以調節載藥水凝膠中藥物的釋放。
圖2 PL-NorHA水凝膠的機械性能和降解性能表征 3. MSCs細胞對PL-NorHA水凝膠的體外反應研究者將MSCs細胞在無血清條件下接種于NorHA、NorHA-RGD和PL-NorHA水凝膠上，體外培養4h和1d后觀察細胞形態。接種在NorHA水凝膠上的細胞通常表現出圓形形態，在1wt.%和2wt.%的濃度下有一些突起，隨著時間的推移顯示出可比的細胞鋪展面積和縱橫比(圖3a)。1wt.%和2wt.%NorHA-RGD組水凝膠可以極大的增加細胞鋪展面積。在PL-NorHA水凝膠(1wt.%和2wt.%)中細胞在培養僅4小時后就粘附、鋪展并呈現紡錘狀形態(圖3a，b)。培養1d后，MSCs呈細長突起，與相鄰細胞形成相互連接的網絡。這些變化可能是PL-NorHA水凝膠形成的纖維狀網絡造成的。它不僅提供了一個臨時的層次化的細胞外基質，給予機械支持和細胞外基質拓撲結構，而且還包含許多結合結構域，介導與細胞、細胞外基質蛋白和生長因子之間相互作用。
圖3 PL-NorHA水凝膠的體外細胞活性評價
4. 微凝膠的制備及表征將含有凝血因子的NorHA(凝血因子)和PL以不同的流量比通過兩個獨立的通道引入到Y形微流控芯片中，匯聚成一個層流的通道以促進纖維蛋白的聚合。然后，這個單一通道被不相容的連續相截斷，產生油包水液滴。經過蛇形路徑時，纖維蛋白進一步聚合，在通道末端經可見光交聯，形成微凝膠（如圖4a）。研究者在微凝膠形成過程中摻入熒光素標記的葡萄糖，以分析其形態（包括大小和圓度）(圖4b，c)。PL-NorHA微凝膠產生了均一和分層的纖維蛋白網絡(圖4b- ii)。球形微凝膠的平均直徑分別為120±12μm(1wt.%NorHA)、126±17μm(1wt.%PL-NorHA)、100±8μm(2 wt.%NorHA)和119±21μm(2 wt.%PL-NorHA)(圖4c-i,ii)。通過糖醛酸和總蛋白的釋放，研究者對微凝膠的降解進行評估。研究發現，微凝膠在透明質酸酶存在時表現出降解趨勢，且濃度低的微凝膠比濃度高的微凝膠降解速度更快；PL-NorHA微凝膠的降解速度比NorHA微凝膠更快；微凝膠狀態的降解速度比水凝膠狀態更快(圖4d-i, iii)。對總蛋白釋放定量，發現7天后，在有或無透明質酸酶的作用下，PL-NorHA的總蛋白釋放量分別為41%±7%和69%±3%。綜上研究表明，微凝膠的穩定性和治療相關蛋白的釋放速率可以通過改變交聯密度以及透明質酸酶濃度來調整。
圖4PL-NorHA微凝膠的制備與表征
5. 顆粒水凝膠的流變特性為了研究微凝膠的可打印性，研究者評估了微凝膠的流變特性和結構(圖5)。振蕩剪切流變實驗結果表明，當NorHA聚合物在微凝膠中的濃度從1%增加到2%時，顆粒水凝膠的儲存模量增加了一個數量級(圖5a-I, iv)。與在水凝膠中的觀察結果一致，PL的存在顯著降低了顆粒水凝膠的存儲模量(分別從77±3Pa降至234±2Pa，2wt.%NorHA和PL-NorHA)。微凝膠具有剪切稀釋性和自愈性的流變特性，可以在不改變初始性能的情況下以最小的力擠出。從不同濃度的微凝膠(1wt.%和2wt.%)制備的顆粒狀水凝膠都隨著應變的增加而表現出剪切屈服(圖5a-ii，v)。通過一系列高(500%)和低(0.5%)應變掃描，觀察到所有顆粒水凝膠的自恢復行為。在受到高應變后，材料表現出快速的類固體行為恢復(圖5a-iii，vi)。為了更好地觀察顆粒水凝膠的結構，研究者在制作油包水液滴前將微凝膠與羅丹明硫醇孵育以進行可視化。結果表明，1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠顯示出非常小的孔隙率，而2wt.%PL-NorHA微凝膠增加了孔隙率，2wt.%NorHA微凝膠的孔隙率最大。這可能是由于微凝膠的粘彈性造成的。微凝膠的低力學擠壓增加了它們的堆積密度，且減小了表面積（圖5B）。
圖5 PL-NorHA顆粒狀水凝膠的流變性和形態表征
6. 3D打印顆粒水凝膠及其體外細胞響應為了評估微凝膠墨水的可打印性，研究者將含有FITC-葡聚糖的微凝膠呈細絲狀打印在載玻片表面，并用熒光顯微鏡觀察(圖6a)。由于其顆粒狀結構，微凝膠墨水很容易擠出形成均勻的細絲，呈現密集堆積的微凝膠形態。進一步，研究者使用微凝膠墨水進行3D打印以制造3D構造(圖6b-i)。濃度較低的微凝膠墨水產生穩定的3D結構(圖6b-ii, iii, v)，濃度較高的NorHA微凝膠產生的結構容易破壞(圖6b-iv)。除了結構的完整性，打印的結構也顯示出高保真度。隨后研究者使用負載MSCs細胞的1wt.%NorHA和PL-NorHA微凝膠進行3D打印。生長在NorHA微凝膠上的MSCs顯示出圓形的形態(圖6c-i)，類似于NorHA水凝膠得到的結果；而PL-NorHA微凝膠中相互連接的微孔空間促進了MSCs細胞的大量遷移與3D細胞網絡的形成(圖6c-i, iii)。這表明PL衍生蛋白可以促進細胞黏附和存活，并且可以形成可提供細胞錨點的分級纖維蛋白網絡。
圖6 3D打印結構穩定性及PL-NorHA微凝膠的體外細胞活性評價。
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