西安交大李昂/成一龍/中科院陳學思《AFM》：綠茶衍生物驅動抗菌水凝膠治療慢性糖尿病傷口
糖尿病（DM）是一種普遍存在的慢性疾病，其特征在于持續的高血糖水平。在糖尿病患者中，預計約19–34％會發展為糖尿病慢性傷口，這是常見，復雜且代價高昂的并發癥。據預測，幾種內在的致病性異常（神經病，血管問題以及由于糖尿病引起的其他復雜的全身影響）和外在因素（傷口感染，愈傷組織形成以及對該部位的壓力過大）都可能導致愈合失敗。盡管尚不能很好地理解皮膚糖尿病性傷口愈合不良的確切機制，但公認的主要病因是氧化應激，血管生成受損，促炎細胞因子表達增加和細菌感染引起的傷口微環境中的慢性炎癥。長期持續傷口的原因。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中最豐富的多酚化合物，近年來引起了相當大的關注。由于EGCG具有多種藥理特性，包括殺菌，抗炎，抗氧化，抗衰老，促血管生成和抗癌作用，因此EGCG已在不同領域得到廣泛評估。然而，EGCG具有一些缺點，這些缺點限制了它們的應用前景，包括不良的生物利用度和快速的代謝。因此，對于糖尿病傷口的治療，非常需要開發合適的藥物遞送系統（DDS），其可以將EGCG有效且精確地遞送至傷口部位并以受控方式釋放多酚。由于缺乏能夠將匹配的機械強度，快速的自愈性，便捷的敷料更換以及多種治療效果整合到一個系統中的理想的傷口敷料，目前對慢性糖尿病傷口的治療仍然不能令人滿意。最近，西安交通大學李昂/成一龍教授和中科院長春應用化學所陳學思院士團隊在《Advanced Functional Materials》上發表了Green Tea Derivative Driven Smart Hydrogels with Desired Functions for Chronic Diabetic Wound Treatment一文。得益于兒茶酚基團和表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（EGCG，綠茶衍生物）的治療作用，研究人員通過將EGCG和3-丙烯酰胺基苯硼酸（APBA）形成的復合物共聚，方便地獲得智能水凝膠敷料）（形成硼酸酯鍵）和丙烯酰胺。所得的水凝膠具有強機械性能，自修復能力和組織粘附性。大量釋放的EGCG不僅可以實現抗氧化，抗菌，抗炎和促血管生成作用，還可以調節巨噬細胞極化來加速傷口愈合，還可以方便換藥。這種先進的水凝膠為糖尿病慢性傷口的處理提供了一種簡便而有效的方法，并且可以擴展用于治療其他復雜的傷口愈合。
為了滿足慢性糖尿病傷口的水凝膠傷口敷料的所有所需特性，作者設計了多功能“智能”水凝膠，利用EGCG和APBA之間的預組裝復合物（E-A復合物）作為動態交聯劑與丙烯酰胺共聚（AM）（圖1a）。由于硼酸酯鍵的動態性質，水凝膠具有適度的組織粘附能力，易于使用，并且可以很容易地從皮膚組織上剝離而沒有任何殘留物（圖1b）；兩次接觸的水凝膠物質僅接觸3分鐘即可有效自修復，承受3倍伸長（圖1c）；這些出色的性能可以確保傷口部位的有效密封，并防止在正常的身體動作和局部壓力下失去保護。此外，EGCG可以以可控的方式原位釋放，發揮抗微生物，抗氧化，促血管生成和抗炎作用，并在臨床所需的時間范圍內加快愈合過程（圖1d）。重要的是，隨著EGCG的釋放，水凝膠網絡逐漸解離，可以通過用傷口清潔劑擦拭或淋洗傷口部位來換藥，從而完全去除水凝膠網絡，從而可以防止新形成的組織受損并改善護理質量。報道的刺激觸發的可溶性水凝膠敷料。
圖1 a）EACPA水凝膠敷料的制備程序示意圖。b）水凝膠粘附在作者的皮膚上。剝離后，未發現殘留物。可以觀察到足夠的粘合性。c）圖片顯示自我修復的EACPA水凝膠承受外力大拉伸的能力。d）在糖尿病C57BL/6小鼠模型中，說明了EACPA水凝膠促進全層傷口慢性傷口愈合的機制如圖2a所示，制備的E-A配合物和AM水溶液（2 m）的混合物在室溫下呈溶膠狀態，并在用氮氣吹掃5分鐘后加入APS和TEMED時經歷了溶膠-凝膠轉變。掃描電鏡（SEM）結果表明，所有EACPA水凝膠樣品均呈現出不規則且多孔的網絡結構，其孔徑為數百微米（圖2b）。較高的E-A絡合物濃度導致降解速率較慢，這是由于增強的交聯密度（圖2c）。使用動態交聯劑形成的水凝膠通常表現出有希望的機械性能，例如良好的可回收性和優異的柔韌性。如圖2d所示，EACPA水凝膠的球形可以立即恢復到初始狀態，壓縮后不會受到任何損壞。此外，EACPA水凝膠的棒狀形狀可承受不同的變形，例如扭曲和彎曲，從而顯示出出色的柔韌性。如圖2e所示，進一步進行了三種水凝膠的拉伸試驗。作者發現系統中E‐A復合物的增加導致拉伸應力和斷裂伸長率提高。具有最高E‐A復合物含量（9 mm）的水凝膠表現出最高的拉伸強度（29.0±6.6 kPa）和最高的斷裂伸長率（661.6±43.4％）。詳細結果總結在圖2f中。
圖2 EACPA水凝膠的形態，降解曲線和力學特性基于硼酸酯鍵的材料在野外條件下會不斷發生反應物（硼酸衍生物和兒茶酚）與產物（硼酸酯）之間的動態交換，因此材料通常具有出色的自愈性能。如圖3a所示，當分離的水凝膠表面接觸時，硼酸酯鍵的重排可立即促進水凝膠的愈合。對于實際應用，敷料在正常的身體運動和局部應力作用下斷裂后的快速自修復可以防止外部感染并為傷口愈合保持無菌環境。如圖3b所示，將粘在作者手指上的水凝膠片切成兩部分，以模仿敷料的破裂。在兩個部分接觸30 s后，已修復的水凝膠可以承受手指的來回彎曲，顯示出出色的實用性。然后進行流變學研究，以評估EACPA水凝膠的自愈行為（圖3c）。
圖3 EACPA水凝膠的自修復和組織粘附特性。a）EACPA水凝膠的自愈過程示意圖。b）宏觀觀察粘附在手指上的EACPA水凝膠的自愈作用。c）在1％和1000％應變之間的五個循環中，使用9 mm E‐A復合物的EACPA水凝膠敷料的G和G。d）在室溫下分別愈合30 s，3分鐘和10分鐘后，水凝膠的拉伸應力-應變曲線。e）EACPA水凝膠在室溫下分別恢復30 s，3分鐘和10分鐘后的自我修復效率摘要（n = 5）。f）EACPA水凝膠的拉伸試驗照片在室溫下愈合10分鐘（紅色圓圈是水凝膠的切割部位。g）對新鮮無骨豬肉片的粘附性和EACPA水凝膠的可擴展性圖像。h）EACPA水凝膠對豬皮膚組織，豬肌肉組織和載玻片的粘附強度EACPA水凝膠的細胞生物相容性通過（3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2-5,5-二苯基溴化四唑（MTT）測定和活/死染色進行評估。不同質量的EACPA水凝膠與細胞培養基在37°C下溫育24 h，浸出后用于細胞培養（L929細胞），首先進行MTT分析以測試水凝膠處理的細胞的代謝活性。如圖4a所示，當水凝膠濃度達到10 mg mL-1時，孵育24小時后細胞活力高于95％，實驗組和對照組之間沒有明顯差異。用活/死染色法觀察細胞的生物相容性，活細胞和死細胞分別用綠色和紅色熒光染色，發現大多數L929細胞呈現正常形態，經10次處理的細胞mg mL-1 EACPA水凝膠表現出相似的作為對照組的增殖趨勢（僅組織培養板）（圖4b）。
圖4 細胞相容性，抗氧化效率，細菌生長抑制作用以及EACPA水凝膠將巨噬細胞表型從M1轉變為M2結果發現，DPPH清除效率表現出EACPA水凝膠濃度依賴性，樣品水凝膠具有明顯的抗氧化性，清除自由基的效率為80％，而水凝膠濃度大于3 mg mL-1（圖4c）。如圖4d所示，在用10 mg mL-1水凝膠處理的L929細胞中觀察到明顯的熒光猝滅，并且熒光強度與對照組相似，與Rosup介導的陽性組相當。以上結果證明，EACPA水凝膠具有所有理想的特性，可作為糖尿病慢性傷口的強大傷口敷料。因此，作者評估了全厚度糖尿病傷口模型上EACPA水凝膠的治療效果。連續5天通過腹膜內注射鏈脲佐菌素（STZ）在C57BL/6小鼠上建立了糖尿病小鼠模型，因為STZ誘導的糖尿病動物模型已被廣泛用于研究糖尿病受損的傷口愈合。血糖在4周內基本上超過300 mg dL-1（16.65 mmol L-1）的小鼠用于治療EACPA水凝膠敷料。接種直徑為8 mm的全厚度背側皮膚穿孔創口，然后分別用Tegaderm膜，EACPA水凝膠敷料或不穿衣服（對照組）進行治療。治療的細節總結在圖5a中。在圖5b中示出了在預定時間間隔的不同組中的傷口的代表性圖片。宏觀上，作者發現EACPA水凝膠的愈合效率比未治療組高得多，觀察18天后，未治療小鼠仍觀察到干sc。此外，根據傷口照片測量了實驗時間范圍內的定量傷口面積（圖5c）。
圖5 EACPA水凝膠對糖尿病慢性傷口的治療效果為了從組織學角度評估EACPA水凝膠敷料的愈合效果，在第18天收集的再生皮膚組織上進行了蘇木精和曙紅（H＆E）和Masson三色染色（MTS）染色。組織學結果與傷口殘留一致在數字圖像中觀察到的區域。在未經治療的對照組中可以觀察到包囊結of中包死的大量炎性細胞，這表明炎癥發生在愈合的早期（圖5d，白色虛線圓圈）。EACPA水凝膠和商業敷料組均維持了減輕的炎癥環境，有利于傷口愈合。EACPA水凝膠組在創面床處形成的肉芽組織在第18天也得到了顯著增強，與商業薄膜敷料組相比，厚約120 μm（圖5e）。此外，EACPA水凝膠組收集的組織也顯示出比對照組和Tegaderm膜組更好的組織結構，其中EACPA水凝膠組可以清楚地觀察到毛囊，皮脂腺，汗腺導管和鱗狀上皮（圖5d ）。此外，進行MTS來檢測新生膠原蛋白在傷口愈合區域的沉積（圖5f）。眾所周知，炎癥微環境在傷口愈合和組織再生過程中至關重要。慢性傷口的炎癥階段被嚴重延長，甚至無法過渡到增殖階段。因此，巨噬細胞主要表現為促炎性M1表型，并產生一系列炎癥細胞因子（即IL-1β）。和白介素-6（IL-6）誘導組織破壞和器官功能障礙；M2表型巨噬細胞的數量，它們分泌高水平的抗炎細胞因子和修復性生長因子（例如，血管內皮生長因子（VEGF），表皮生長因子（EGF））以減少炎癥，調節肉芽形成并促進組織再生，大大減少了。由于這些細胞因子和生長因子高度參與傷口愈合過程的不同階段，為進一步探索EACPA水凝膠敷料減輕炎癥反應和促進組織愈合的機制，在不同治療后三天收集傷口周圍的組織（圖6a）和傷口組織中趨化因子的含量首先通過ELISA分析檢測（圖6b）。
圖6 EACPA水凝膠調節炎癥微環境，以促進慢性糖尿病傷口的愈合。a）在進行以下測試的不同處理后的第3天收獲傷口組織。b）通過ELISA測定與傷口組織中的炎癥和血管生成有關的趨化因子的濃度。c）第3天，皮膚傷口組織中IL-1β（紅色）和細胞核（藍色）的免疫熒光圖像。d）IL-1β相對覆蓋面積的定量分析。e）處理后用F4/80（紅色）和CD163（綠色）染色的傷口組織中巨噬細胞的免疫熒光圖像論文鏈接：doi.org/10.1002/adfm.202009442
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